Введение
2: Обзор литературы
2.1 Общие положения
2.2. Альфа-подобные фнтовнрусы; содержащие тройной блок генов
2.2.1. Семейства Tubmieidae. 12
2.2.1.1.Род.е/іртипаг 12
2.2.1 .2. Род Pomovirus. 14
2.2.1.3. Род Pecluvirus.
2.2.1.4. Род Hordeivirus
2 2.2.2. Порядок Tymovirales
2.2.2 Г. Семейство Potexviridde
2.3: Методы изучения локализации транспортных белков фитовирусов 22
2.3.1.1. Субклеточное фракционирование белков ТБГ 22
2.3.1.1.1.Субклеточная локализация 6ТБП 21
2.3.1.1.2. Субклеточная локализация белков-ТБГ2 иТБЕЗ. 24
2.3.1.2. Субклеточная локализация транспортных белков тобамовирусов 25
2.3.1.3. Субклеточная локализация транспортных белков витивирусов, порядок Tymovirales 26
2.3.1.4. Субклеточная локализация транспортных белков представителей семейства Bromoviridae 27
2.3.1.5. Субклеточная- локщгазащгаг гранстгортных белко представителей семейства Comoviridae 27
2.3.1.6. Субклеточная локализация транспортных 28
белков представителей семейства Tombusviridae
2.3.2. Электронная микроскопия транспортных белков 28
2.3.2.1. Электронная микроскопия белков ТБГ 28
2.3.2.2. Электронна* микроскопия: транспортных: белков других вирусов растений 29
2.3.3. Изучение локализации транспортных белков методом лазерной конфокальной микроскопии 31
2.4 Изучение локализации, белков ТБГ методом флуоресцентной микроскопии 32
2.4. Комплементационный анализ транспортных белков 33
2.4.1. Гомологичная комплементация транспортных белков 33
2.4.2. Гетерологичная комплементация транспортных белков 34
2.4.2.1. Гетерологичная комплементация транспортных белков в положении т cis 35
2.4.2.2. Гетерологичная комплементация транспортных, белков в положении in tram 37
2.4.2.2.1. Гетерологичная комплементация транспортных белков с помощью рекомбинантньгх конструкций 38
2.4.2.2.2. Гетерологичная комплементация транспортных белков вирусов в трансгенных растениях 39
2.4.2.2.3. Гетерологичная комплементация вирусного транспорта с использованием вирусов-помощников 41
2.5. Структура и свойства белков тройного блока генов . 42
2.5.1. Особенности первичной структуры белка ТБГ1 43
2.5.2. Особенности первичной структуры белков ТБГ2 иж ТБГЗ 44
2.5.3. Экспрессия белков ТБГ 45
2.5.4. Биохимические и функциональные свойства белка ТБП 47
2.5.5. Функции белков ТБГ2 и ТБГЗ 50
2.5.6. Возможная схема транспорта ТБГ-содержащих вирусов 52
3. Материалы и методы 54
3.1. Реактивы и материалы 54
3.2. Ферменты и наборы 54
3.3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы. 55
3.4. Среды, использовавшиеся при культивировании 55
3.5. Выделение плазмидной ДНК 55
3.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидной 56
3.7. Электрофорез в агарозном геле 57
3.8. Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля, 57
3.9. .Цитирование фрагментов ДНК 57
3.10. Трансформация растительных тканей 57
3.11. Трансформация бактериальных клеток A. Uimefaciens плазмидной ДНК 58
3.12. Выделение тотального препарата нуклеиновых кислот из клеток A. tranefeciens 59
3.14. Рестрикционный гидролиз тотального препарата ДНК, выделенного из клеток A.tumefaciens 60
3.1.5.ДНК-блотинг 61
3 1 6. Гибридизация нуклеиновы кислот, иммобилизованных. на найлоновом фильтре 62
3.17. Синтез зонда для гибридизации. 62
3.18. Выделение препарата тотальной РНК из растительных тканей 63
3.19.Электрофорез РНК в денатурирующем геле 64
3.20.йммунодетекция белков 64
3.21. Субклеточное фракционирование растительных тканей 65
3.22. Разделение клеточных мембран в градиенте плотности сахарозы 66
3.23. Экстракция белков из препарата мембран. 67
3.24. Выделение РНК из фракций протяженного градиента сахарозы 67
3.25. Флотация мембранных препаратов 67
4.Результаты 68
4.1. Получение трансгенных растений, экспрессирующих
белок ТБГЗ ГОТОМ и белок ТБГЗ ПЛВМ, слитого с GFP. 68
4.2. Иммунодетекция белков 18К и GFP-18K в трансгенных и зараженных растениях. 70
4.3. Эпифлуоресцентная микроскопия трансгенных растений, экспрессирующих. ген. белка GFP- 18К. 78
4.4. Функциональная активность белков 18К и GFP-18K, экспрессируемых в трансгенных растениях 79
4.5. Субклеточное фракционирование растительных тканей, экспрессирующих белки 18К и GFP-18К 81
4.6. Исследование мембранной природы белков 18К и GFP-18К. 82
4.7. Локализация белков 18К и GFP-18K в
эедоплазматическом ретикулюме. 86
Обсуждение результатов 93
Выводы 100
Список литературы 101
